【摘要】：目的脾胃濕熱證是感受濕熱之邪,或過食肥甘厚膩,或脾氣虛弱,濕邪中阻,久之釀成濕熱,內蘊脾胃而表現的一類病證,為嶺南地區的常見病、多發病。其臨床癥狀復雜,病程較久,病勢纏綿難愈,治療較為困難。本實驗根據脾胃濕熱證的發病特點,通過“高脂高糖飲食+人工熱氣候模擬艙+生物致病因子”復合因素構建脾胃濕熱證動物模型,用ELISA法檢測血清Th1/Th2細胞因子IFN-γ/IL-4的表達水平；用SABC法檢測胃粘膜上皮細胞凋亡基因相關蛋白Bcl-2、P53;并取大鼠胃、十二指腸和結腸組織行病理切片,HE染色觀察胃腸道炎癥情況。探討脾胃濕熱證與細胞免疫平衡、細胞凋亡之間的關系及王氏連樸飲的療效,擴大脾胃濕熱證的研究范圍,加深對脾胃濕熱證生物學基礎及發病機制的認識,提高脾胃濕熱證的現代研究及臨床診療水平。方法1.藥物和飼料王氏連樸飲藥物組成：制厚樸6克,川連、石菖蒲、制半夏各3克,香豉、焦山梔各9克,蘆根60克。高脂高糖飼料：普通飼料中混入12%豬油,8%蜂蜜加工而成。2.實驗動物分組將50只雄性SPF級SD大鼠適應性飼養3天后,隨機分為5組：正常對照組、脾胃濕熱模型組、王氏連樸飲(高、中、低劑量)組。

每組10只。3.方法本實驗擬通過高脂高糖飲食+人工熱氣候模擬艙(環境設置為：干球溫度33±0.5℃,相對濕度65+5%)+生物致病因子(109CFU/ml鼠傷寒沙門氏菌)制成脾胃濕熱證模型：①正常對照組：在20-28℃溫度,65+5%相對濕度的自然環境下,以普通混合飼料喂養。②脾胃濕熱證模型組：高脂高糖飼料+人工熱氣候模擬艙(環境設置為：干球溫度33±0.5℃,相對濕度65±5%；每日上午9時至11時放入大鼠)。③王氏連樸飲高劑量組：高脂高糖飼料+人工熱氣候模擬艙(環境設置為：干球溫度33±0.5℃,相對濕度65±5%；每日上午9時至11時放入大鼠)④王氏連樸飲中劑量組：高脂高糖飼料+人工熱氣候模擬艙(環境設置為：干球溫度33±0.5℃,相對濕度65±5%；每日上午9時至11時放入大鼠)。⑤王氏連樸飲低劑量組：高脂高糖飼料+人工熱氣候模擬艙(環境設置為：干球溫度33±0.5℃,相對濕度65±5%；每日上午9時至11時放入大鼠)。模型組與王氏連樸飲高、中、低劑量組第18天移出置于自然環境,按2ml/200g予鼠傷寒沙門氏菌灌胃1次,24小時后加強感染1次(1ml/200g)。第20日起王氏連樸飲高、中、低劑量組大鼠按2ml/200g灌服相應濃度的藥物,正常對照組和脾胃濕熱模型組灌服等容積生理鹽水。

每天給藥一次,持續7天。4.觀察及檢測指標實驗期間每天記錄大鼠飲水量和攝食量,分別于第10天、第18天和給藥后測定大鼠體重,造模前、后及給藥后測定肛溫。實驗結束后腹主動脈采血,離心后取血清,運用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清IFN-γ和IL-4水平。取胃、十二指腸、大腸組織行光鏡下病理組織學檢查。按照免疫組織化學試劑盒說明書運用SABC法檢測大鼠胃粘膜上皮細胞凋亡蛋白Bcl-2、P53的表達。5.數據統計原始數據采用SPSS13.0統計軟件進行錄入和分析,采用(x±s)等統計學指標進行數據的統計描述。體重、肛溫、攝食量、飲水量采用重復測量(Repeated measured)方差分析,IFN-γ和IL-4水平進行One-way ANOVA分析,方差齊性采用LSD進行兩兩比較,方差不齊性的采用Dunnett T3進行兩兩比較,等級資料采用秩和檢驗。設定P0.05表示統計學有顯著性差異。結果1.大鼠一般狀態和攝食量、飲水量的變化實驗前：所有動物狀態良好,活動靈活,皮毛潔白有光澤,活動正常,攝食量飲水量正常,大便成形,小便、體溫正常。實驗后：正常對照組大鼠精神狀態好,皮毛有光澤,反應靈敏,飲水量和攝食量均衡。

第1天各組大鼠表現一致,無特異性差別。各造模組大鼠隨著造模時間的推移,大部分出現倦怠、嗜臥懶動,反應遲鈍,毛發蓬松,顏色枯槁,飲食飲水減少,排便次數增多。從造模第10天開始,均出現大便溏泄或粘膩,體溫較前升高較快；進入人工熱氣候模擬艙后,大便溏泄或粘膩癥狀加重,漸見肛周污穢,攝食量和飲水量有減少的趨勢,但統計學無顯著性差異(P0.05)。王氏連樸飲(高、中、低劑量)組灌服王氏連樸飲后,活動逐漸增強,飲水、飲食量增加(P0.05),大便漸漸恢復正常。2.體重和肛溫正常對照組大鼠體重呈進行性增長,肛溫無明顯改變。與正常對照組比較,脾胃濕熱模型組和王氏連樸飲高、中、低劑量組大鼠體重增長緩慢,但統計學無顯著性差異(P0.05),各組肛溫均顯著升高(P0.001)。給藥后,王氏連樸飲高、中、低劑量組大鼠體重增長較模型組均有加快的趨勢,但統計學無顯著性差異(P0.05)；給藥組大鼠肛溫均顯著降低(P0.05)。3.血清IFN-γ/IL-4比值與正常組相比,模型組與王氏連樸飲(高、中、低劑量)組血清IFN-γ、IL-4顯著增高(P0.01)；模型組與王氏連樸飲(中、低劑量)組IFN-γ/IL-4呈增高趨勢,但無顯著性差異(P0.05)；王氏連樸飲高劑量組IFN-γ/IL-4顯著增高(P0.01)。

與模型組相比,王氏連樸飲(高、中、低劑量)組能顯著降低血清IFN-γ、IL-4水平(P0.01)；王氏連樸飲(中、低劑量)組IFN-γ/IL-4呈增高趨勢,但無顯著性差異(P0.05)；王氏連樸飲高劑量組IFN-γ/IL-4顯著增高(P0.05)。4.胃粘膜上皮細胞Bcl-2、P53蛋白表達與正常組相比,脾胃濕熱證模型組Bcl-2,P53蛋白表達顯著增強(P0.05),王氏連樸飲(高、中、低劑量)組Bcl-2,P53蛋白表達輕度增加,但無顯著性差異(P0.05),其中以中劑量組最為接近正常組,效果最好。5.胃、十二指腸、大腸粘膜組織形態結構改變HE染色后,正常組大鼠胃粘膜層結構完整,十二指腸、大腸絨毛排列緊密,柱狀上皮排列整齊。模型組大鼠胃粘膜組織不同程度充血水腫,固有層和粘膜下層可見大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞堆積；十二指腸和大腸可見粘膜組織充血水腫,上皮脫落、壞死,大量炎細胞浸潤。王氏連樸飲高、中、低劑量組與模型組比較,大鼠胃粘膜結構清楚,十二指腸絨毛上皮較完整,固有層可見散在的炎細胞浸潤。結論1.在“高脂高糖飲食+人工熱氣候模擬艙+生物致病因子”復合因素作用下,大鼠的癥狀、體征等表現與脾胃濕熱證的臨床癥候類似；經過王氏連樸飲治療后,脾胃濕熱證模型大鼠癥候逐步恢復正常,也反證了脾胃濕熱證大鼠模型造模成功。

因此,“內濕熱+外濕熱+生物致病因子”可成功復制脾胃濕熱證模型,模型大鼠可出現與脾胃濕熱證的臨床類似癥候。2.脾胃濕熱證模型組大鼠血清Th1、Th2細胞因子IFN-γ、IL-4表達水平明顯升高,提示脾胃濕熱證處于正邪抗爭的病理狀態,存在免疫平衡失調,細胞因子網絡調節紊亂,有向Th1反應漂移的趨勢。3.脾胃濕熱證模型組Bcl-2, P53蛋白表達顯著增強,表明細胞凋亡參與了脾胃濕熱證發病的免疫調節及免疫耐受,細胞增殖與凋亡平衡紊亂促進脾胃濕熱證的發生與發展。4.模型組大鼠胃粘膜組織充血水腫,固有層和粘膜下層可見大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞；十二指腸和大腸可見粘膜組織充血水腫,上皮脫落、壞死,大量炎細胞浸潤,表明脾胃濕熱證臨床所表現的癥狀有一定的形態結構基礎。5.王氏連樸飲藥物組成：制厚樸6克,川連、石菖蒲、制半夏各3克,香豉、焦山梔各9克,蘆根60克。功用：清熱化濕,理氣和中。臨床主要用于濕溫之濕熱中阻證。本實驗中王氏連樸飲對脾胃濕熱證大鼠胃腸道粘膜細胞損傷有保護和修復作用。其清熱祛濕的作用機制還可能與其調節Th1/Th2平衡、誘導脾胃濕熱證大鼠胃粘膜上皮細胞凋亡及抑制機體炎癥反應相關。